Comprendre la PCR

I - Comprendre la PCR
II - Comprendre et interpréter le résultat
II a) - Mesure de l'efficacité du TTT: la réponse virologique soutenue, la rechute, la non réponse.
II b) - les différentes méthodes, techniques de PCR
III - les différentes unités pour le résultat et la conversion d'une unité à une autre.


I - Comprendre la PCR

PCR est l'abréviation de Polymerase Chain Reaction.
C'est une méthode d'analyse par amplification du signal de l'
ARN du VHC.
La présence d'ARN
virale indique que le virus est en train de se répliquer (en se reproduisant le virus infecte de nouvelles cellules).
Le test de la
charge virale est habituellement effectué dès qu'une personne s'avère avoir été exposée au VHC suite à un test de dépistage basé sur la présence d'anticorps au VHC.

glossaire:
http://hepatites.net/index.php?module=p ... amp;id=123

Elle est réalisée à partir d'un prélèvement de sang et analysée en laboratoire avec des méthodes et appareils spécifiques.

Il existe 2 types de PCR pratiquées suivant les moments et besoins.
L'une permet d'évaluer la quantité de virus circulant dans le sang, c'est la PCR quantitative dont les résultats sont donnés en
log, copies,ou UI (Unités Internationales).
L'autre technique permet d'affirmer simplement la présence ou l'absence de virus, c'est la PCR qualitative. Les résultats sont indiqués avec les mots "positif" ou négatif".

Les techniques de PCR sont relativement récentes dans l'histoire, l'
ADN polymerase n'ayant été découverte qu'en 1970 et le première PCR avec une ADN polymerase date de 1988. Les recherches continuent donc pour les améliorer et on peut comprendre que ces techniques aient des limites dont le seuil de détection.

Le seuil de détection est la limite basse de la technique utilisée. Si il y a présence de virus en dessous de ce seuil (toujours indiqué sur la feuille d'analyse), les techniques actuelles ne permettent ni d'affirmer la présence ou absence de virus ni de quantifier la quantité.

La PCR est réalisée à partir d'un prélèvement de sang.
*il est recommandé de toujours faire toutes ses analyses dans le même laboratoire, compte tenu de variables pouvant exister.

Les PCR sont réalisées :
- avant le
TTT (traitement) pour avoir pour avoir une indication sur la quantité de virus.
Un autre examen appelé sérotypage, permet de trouver trace des anticorps même si cette PCR est négative. Dans ce cas, ça signifie que la personne a été en contact avec le virus du VHC mais l’a éliminé spontanément sans développer d’hépatite chronique.
- pendant le TTT pour avoir une indication sur la diminution espérée. Les PCR sont recommandées pour tous les patient:
. à la 4ème semaine (S4) sur avis spécialisé
. à la 12ème semaine (S12)
. à la 24ème semaine (S24) pour les personnes avec un
génotype 2 et 3
. à la 48ème semaine (S48) pour les personnes avec un autre génotype.
. 6 mois après le TTT pour tous.

Il faut vraiment comprendre que les PCR servent d'indicateurs uniquement. La sévérité de la maladie ne dépend pas de la quantité de virus présent dans le sang. Les résultats s'interprètent par comparaison avec les analyses antérieurs, d'où l'utilité d'effectuer une première PCR avant le TTT.

II - Comprendre et interpréter le résultat


II a) - Mesure de l'efficacité du TTT: la réponse virologique soutenue, la rechute, la non réponse.

On dit que la charge virale ou CV est positive ou + lorsque la PCR permet d'affirmer la présence de virus et que la charge virale est négative ou - lorsque la PCR ne permet pas d'affirmer la présence de virus ou de la quantifier selon les méthodes existentes actuelles.

Lorsque la charge virale ou CV du VHC est quantifiée, elle est souvent considérée comme étant faible ou élevée.
Exprimée en copies/mL :
• Faible : moins de 2 millions de copies
• Élevée : plus de 2 millions de copies

Exprimée en unités internationales (UI/mL) :
• Faible : moins de 800 000 UI/mL
• Élevée : plus de 800 000 UI/mL

Pendant le TTT une bonne réponse à celui-ci est déterminée par la baisse de la CV, jusqu'à la négativation.

-Si 6 mois après le TTT la PCR qualitative confirme toujours la négativation, on parle alors de RVS, Réponse virologique soutenue.
Durant le TTT, une bonne réponse se caractérise par une baisse de la charge virale de 2 logs ou plus au cours des 3 premiers mois, soit à la PCR de S12 continuant jusqu'à la négativation.
une diminution de 1 000 000 UI/mL à 10 000 UI/mL correspond à une diminution de 2 logs.

- si pendant le TTT, le patient négative puis repositive, on parle alors de rechute et de patient rechuteur.

- si pendant toute la durée du TTT, la négativation n'est pas obtenue, on parle alors de non réponse et de patient non
répondeur.

Attention: ceci est un schéma standard qui ne tient compte d'aucune des particularités d'une personne comme par exemple la possibilité d'être un répondeur lent ou rapide....
Aujourd'hui suivant l'évolution de la CV de chacun, il peut être possible de raccourcir ou rallonger la durée initiale prévue d'un TTT:

- Pour le génotype 2 et 3, une charge virale de départ faible < 600 000 copies la durée initialement prévue du TTT (24 semaines)pourra éventuellement être réduite à 16 semaines.

- Pour le génotype 1 une charge virale de départ faible < 600 000 copies et avec une PCR négative à S4,la durée initialement prévue du TTT (48 semaines) pourrait éventuellement être réduite à 24 semaines.

A l'inverse avec une charge virale importante et une réponse lente, il pourrait être envisagé de rallonger le TTT.

Les PCR permettent d'évaluer également l'efficacité d'un TTT dit d'entretien lorsqu'il s'agit simplement de contenir ou tenter de faire régresser l'évolution de la
fibrose chez les patients cirrhotiques non répondeurs.


II b) - les différentes méthodes, techniques de PCR


Les noms sont barbares, peu importe lI s'agit simplement de montrer que chaque technique a un seuil minimal pour mesurer la charge virale. Chaque technique possède aussi des avantages et des inconvénients. Cela montre aussi l'intérêt d'effectuer l'analyse dans le même laboratoire à chaque fois: il utilisera toujours la même technique avec le même seuil ...

La quantification de l'ARN du VHC dans le sang fait appel à des techniques spécifiques qui peuvent se classer en deux groupes : les techniques d'amplification de la cible et les techniques d'amplification du signal. En pratique, en France, 2 tests sont actuellement commercialisés et largement utilisés pour la quantification de l'ARN du VHC

a) l'un est fondé sur l'amplification de la cible : il s'agit d'une transcription inverse - PCR quantitative non compétitive (Amplicor HCV Monitor ) pour lequel il existe maintenant une version automatisée sur l'automate Cobas Amplicor évitant là encore le risque de contamination croisée.

b) L'autre est fondé sur l'amplification de signal par ADN branché et on dispose maintenant de la 3e génération du test VERSANT HCV RNA 3.0 Assay (bDNA).

Ces deux tests associent une très large zone de linéarité avec une haute sensibilité analytique, ils possèdent une bonne reproductibilité et permettent de quantifier la charge virale quel que soit le génotype. La plupart des étapes de manipulations sont automatisées
et il existe une bonne corrélation entre les deux méthodes jusqu'à environ 5 105 UI/ml.


Les techniques de PCR qualitative sont aujourd'hui les techniques de détection de l'ARN du VHC les plus sensibles. La méthode la plus souvent utilisée est un test commercial (Amplicor HCV, Produits ROCHE) dont la sensibilité est environ 100 copies/ml ou 50 UI/ml. Le risque de faux-positifs par contamination croisée, est réduit lorsque le test est réalisé sur l'automate COBAS Amplicor
technique Monitor (Roche) seuil = 1000 copies/ml. Semiautomatisation sur appareil Cobas.
PCR (Technique Monitor Roche automatisée)Sensibilité: 100 cp/ ml pour les nouveaux tests


Une autre technique a été récemment commercialisée. Elle s'appelle Transcription-Mediated Amplification ou TMA-Base HCV RNA testing (Bayer). La sensibilité de cette technique est d'environ 50 copies/ml, quel que soit le génotype soit environ 5 UI/ml.


D'autres techniques sont en cours de développement. Elles utilisent une méthodologie de PCR en temps réel: l'une utilise le TaqmanTM (Perkin Elmer) et l'autre le Light CyclerTM (Roche-Boehringer). Elles seront certainement les méthodes de quantification virale de demain car elles permettent de mesurer le nombre de copies produites durant la
phase cinétique de la réaction de PCR


PCR quantitative en temps système TaqMan, et Light Cycler à sensibilité, seuil < 10 copies /ml


Pour la plupart d'entre nous les PCR quantitatives avaient un seuil à 615 UI/ml et les PCR qualitative un seuil à 50 UI/ml

On voit que la détection, déjà très fine le sera encore plus avec les nouveaux tests.

Il faut penser que ces seuils bas représentent des quantités de virus infimes dans l'organisme et qu'en dessous de ces seuils, même si le virus existe toujours, celui-ci ne réactivera pas l'évolution de l'hépatite et restera sous contrôle du système immunitaire.


III - les différentes unités pour le résultat et la conversion d'une unité à une autre.

Les résultats des PCR qualitatives sont exprimées avec les mots positif ou négatif suivant que la présence ou l'absence de virus a été détectée.

Les résultats résultats d'une PCR quantitatives sont exprimées dans 3 unités équivalentes:

xxx copies/ml de sang = xx UI (unités internationales)/ml de sang = x logs

Les copies ne sont pas une unité internationale. Elle ne permet pas d'équivalence d'un pays à l'autre, d'où l'utilité de l'expression d'un même résultat en log.
Les logs sont une expression mathématiques donc un langage international. Et plus récemment l'OMS a validé l'expression en UI qui est un langage commun, uniforme et standardisé.
Ce langage commun a tous est une nécessité pour la recherche.

Certaines personnes aiment à comprendre l'équivalence entre ces unités et parfois effectuer elles-même les conversions. Le plus souvent le résultat de la PCR quantitative est en France, indiquée dans les 3 unités.


Des copies aux logs.... selon un document d'Act Up

http://www.actupparis.org/article2221.html

logarithme ou log

Vient du grec logos : rapport et ariosos : nombre, couramment abrégé en log. Ce mot désigne la puissance à laquelle il faut élever une constante pour obtenir un nombre donné. Exemples :
log 1 = 0, log 10 = 1, log 100 = 2, log 1 000 = 3, log 10 000 = 4.

Ou encore
500 copies/mL = 2,7 log,
1 000 copies/mL = 3,0 log
5 000 copies/mL = 3,7 log
10 000 copies/mL = 4,0 log
100 000 copies/mL = 5,0 log

Elle s’exprime en nombre de copies par mL et ceci sur une échelle de 1 à 1 000 000 ou en logarithme (log) de ce nombre (sur une échelle de 0 à 6).
Le log est une fonction mathématique telle que
log 1 = 0
log 2 = 0,3
log 3 = 0,48
log 4 = 0,6
log 5 = 0,7
log 6 = 0,78
log 7 = 0,84
log 8 = 0,9
log 9 = 0,95
log 10 = 1
log 100 = 2
log 1 000 = 3
log 10 000 = 4
log 100 000 = 5
log 1 000 000 = 6

Les variations croissantes ou décroissantes de la charge virale peuvent aussi s’exprimer sous forme de 1 log, 2 log, etc.

Cette fonction permet de remplacer la multiplication de nombres par l’addition de leur logarithme, car log (a x b) = log a + log b.

Exemple : une charge virale de 100 000 copies/mL, équivaut à une charge virale de log 5. En cas de baisse d’un log, elle correspond alors à 10 000 copies/mL.


EXEMPLE : une charge virale de 12 000 copies / ml s’exprime en log de la façon suivante :

12 000 copies = log (2 x 6 x1000) = log 2 + log 6 + log 1000 = 0,3 + 0,78 + 3 = 4,08


Conversion des copies par millilitre aux unités internationales.

Aucune formule de conversion standard n’existe pour convertir la quantité de l’ARN du VHC calculée en copies par millilitre à la quantité calculée en unités internationales. Le facteur de conversion
se situe approximativement de une à cinq copies d’ARN du VHC par UI. Habituellement, le rapport de laboratoire donne la conversion d’UI/mL en copies/mL. Voir plus bas pour obtenir un exemple de conversion d’un test de la charge virale d’UI en copies.

Méthode
• Amplicor HCV Monitor v2.0“
(procédure manuelle)
• 1 IU/mL = 0,9 copie/ml

•Cobas Amplicor HCV Monitor v2.0“
(procédure semi-automatisée) • 1 IU/mL = 2,7copies/ml

•Versant HCV RNA 3.0 Méthode quantitative
• 1 IU/mL = 5,2 copies/ml

•LCx HCV RNA méthode quantitative • 1 IU/mL = 3,8 copies/ml

•SuperQuant • 1 IU/mL = 3,4 copies/ml

Si on n'est pas trop doué en maths, des hépatants: Alain et Mental-O, ont créé un excellent outil pour réaliser soi-même ses conversions : une calculette.

Pour s'en servir, après téléchargement,il suffit de remplacer les nombres indiqués par ses propres résultats d'analyse.

Voici d'abord une version simple:
http://hepatites.net/index.php?name=PNp ... mp;id=1662


puis une version plus complête ici:
http://hepatites.net/index.php?name=PNp ... mp;id=1663

Ce document viens de hépatite.net
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